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    本發明係關於一分離自地下水的新穎細菌株。本發明亦關於細菌萃取物及關於其於發炎之治療的內容之用途。更特別地，本發明係關於有興趣的新穎組成物於發炎病症的治療及預防，尤其是皮膚科病狀。
    公开号:TW201307551A
    申请号:TW100147712
    申请日:2011-12-21
    公开日:2013-02-16
    发明作者:Philippe Lebaron；Muriel Bourrain；Nathalie Castex-Rizzi；Thien Nguyen
    申请人:Fabre Pierre Dermo Cosmetique；Univ Paris Curie；Centre Nat Rech Scient；
    IPC主号:A61K35-00
    专利说明:
    新穎細菌及該細菌之萃取物以及其於皮膚科之用途 技術領域
    本發明係關於一分離自地下水的新穎細菌株。本發明亦關於細菌萃取物及關於其於發炎之治療的內容之用途。
    更特別地，本發明係關於有興趣的新穎組成物於發炎病症的治療及預防，尤其是皮膚科病狀。 發明背景
    皮膚科疾病諸如異位性皮膚炎、搔癢、濕疹以及牛皮癬在年輕兒童中係逐漸增加地頻繁，異位性皮膚炎在已開發國家中的普及率在過去30年來已加倍或三倍：15%至30%的兒童以及2%至10%的成人有受到影響(Williams H. et al.,JACI 2006;118:209-13)。異位性皮膚炎是特異體質過敏症的皮膚表現形式；其為慢性發炎的皮膚病或濕疹，由於遺傳上所決定的狀態樣組而發生，其現在被視為是重要的公共衛生議題。異位性皮膚炎通常與其他異位性病症諸如過敏性鼻炎及氣喘有所關聯。此病症最常出現在孩提早期且特徵為幾年間反覆的爆發。其病程為突發伴隨以自發性緩解中斷。
    對於遭受異位性皮膚炎的病患，生活品質係深深地受到干擾。已接受的治療包括局部性皮質類固醇及免疫調節劑、其頻繁的副作用限制長期使用的全身性藥劑、以及緩和劑。當今的療法係反應性-爆發的治療-但現在相信早期介入專注於爆發以及皮膚發炎的控制就疾病的控制及潛在的氣喘及/或鼻炎的出現兩者而言可為有益的(Bieber,T. 2008,Atopic dermatitis,The New England Journal of Medicine,vol. 358(14) 1483-1494)，因為異位性皮膚炎被視為異位性進程的初始階段。在大部分的案例中，治療包括局部組分以最佳地對病患提供緩解。
    對於異位性皮膚炎的標準治療特別使用局部性皮質類固醇或免疫抑制劑，雖然此等治療並不是沒有不良的影響，特別是對於兒童。
    異位性皮膚炎是複雜且多因素的。在文獻中，某些流行病學的研究已經顯示市區環境中的「衛生」因素提升如過敏及自體免疫的疾病。另一方面，在郊區環境中，其中人們經常接觸微生物及/或過敏原，此等暴露刺激人們從出生以來的防禦性免疫系統。
    在異位性皮膚炎中，皮膚的障壁功能係弱化且受損的，其促使致病原(細菌、病毒)的入侵及拓殖，特別是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，其已知在皮膚的共生細菌中佔有優勢。
    就免疫學而言，此議題為一種免疫反應失衡。特異體質過敏症通常被描述為過敏的表現形式(由IgE所媒介，主要為細胞激素IL-4、IL-5、IL-13)或Th2反應。後者在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的「抗原性刺激物」存在下係更加強化。免疫調節作用在於回復免疫衡定至Th1/Th2平衡。
    先天免疫是哺乳類中免疫反應的原始、快速及非特異性的反應。細胞的第一防禦障壁包括類鐸受體(Toll-like receptors)(TLRs)。各個TLR會特異性地辨認病原相關分子型態(PAMPs)，諸如源自外來微生物的核酸(TLR3)、胜肽、表面蛋白、脂壁酸(TLR2)、鞭毛(TLR5)以及脂多醣(TLR4)。一部位(motif)(同效劑)與一TLR之間的特異性交互作用引發一階層的複雜反應，導致NFκB的轉錄作用，繼而產生促發炎及抗發炎細胞激素以及趨化激素(Kang et al.,2006)。其他所導致的藥理學結果為抗菌胜肽(AMPs)的誘導，其具有抑制致病原(細菌、病毒、寄生蟲)生長的能力(Glaser,R. et al. 2005,Nat. Immunol. 6:57-64)。
    異位性皮膚炎通常伴隨搔癢及搔癢病，因而造成日常生活之不適與煩惱(抓搔、睡眠喪失等等)。此發炎病理的原因之一為基於稱為PAR2(蛋白酶活化受體2)的G蛋白偶合受體之活化(Steinhoff,M. et al. 2003 J Neurosci. 23:6176-6180)。PAR2表現在許多細胞的表面上，特別是角質細胞、內皮細胞、結腸肌細胞、腸細胞、腸神經元及免疫細胞。在表皮中大量存在的蛋白酶(胰蛋白酶、中性蛋白酶)在N端切割PAR2、暴露一特定胜肽，其活化此相同的受體(自我活化的現象)(Vergnolle,N. 2009 Pharmacol. Ther. 123:292-309)。此過程涉及NFκB基因的活化，繼而促發炎細胞激素的誘導，因而引發發炎。在此脈絡下，PAR2拮抗劑及/或蛋白酶抑制劑的發展對於治療搔癢的病理具有高度潛力。
    牛皮癬亦為一具有慢性進程的皮膚發炎疾病；其影響2%的人口。與異位性皮膚炎一起，牛皮癬為最常見的慢性皮膚發炎疾病之一。其特徵在於與發炎反應有關的表皮細胞異常生長。發炎現象的中心機制是關於免疫系統的T細胞之作用，主要是Th1細胞(Wilsmann-Theis,D. et al.,Eur J Dermatol.,vol. 18(2) 172-180)，其起始且維持發炎過程並刺激角質細胞的過度生長，其而後進展經過一經加速且不完全的分化期。角質細胞表現受體，其使得其等對於發炎訊息敏感並且釋放促發炎媒介物。牛皮癬性發炎藉由T細胞與角質細胞的互相刺激因而維持。
    此疾病因此必須長時間治療，因此對於此等發炎皮膚病的治療性替代品有需要及高度需求。
    可提及專利文獻EP2018891(Guniche A.,2009)及Guniche A.等人2006(European Journal of Dermatology,16,4,380-384)的文獻，其描述線狀透明顫菌(V. filiformis)的細菌萃取物於治療異位性皮膚炎之用途，如此之萃取物具有需要在含無硫礦泉水的培養基上培養該線狀細菌V. filiformis之缺點。 發明概要
    在本文中，本發明藉由分離、特徵描述及分部分離一在之前從未被描述過的新穎細菌而對治療該等發炎病症提供解決方式。
    做為第一次、且於驚人的方式，申請人成功從地下水分離出一屬於新穎細菌物種的菌株，其中該新穎菌株(或細菌)命名為LMB64。
    此細菌LMB64，除了被分離的事實之外，也被描述特徵及定義為屬於乙型變形菌綱(Betaproteobacteria)，奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)之亞科，且可能為尚未被定義的新穎屬別。分析編碼16S核糖體RNA(rRNA)的基因序列使得將此細菌歸於接近色桿菌(Chromobacterium)屬、Paludimonas屬、Lutelia屬及Glubenkiana屬成為可能，其與該等屬別共有95%序列相似性。
    此非致病性細菌為革蘭式陰性且將在實施例中更詳細地描述，此細菌亦具有為非線狀的特徵，此外，此細菌具有能夠在含有任何類型的水的培養基上培養之優點，且更特別地，為一般水。例如，相對於線狀透明顫菌(V. filiformis)，本發明細菌LMB64的培養不需要特定的培養條件，且更特別地，不需要含有至少一無硫型礦泉水及/或溫泉水之培養基。就培養條件及設備兩者以及從經濟的觀點，此表現明確的優點。
    編碼16S rRNA的基因幾乎已被完整地定序(1487 bp，對應於序列SEQ ID No. 1)。細菌LMB64具有10948 bp的環狀質體，此質體被完整地定序且序列於序列SEQ ID No. 2中呈現。 圖式簡單說明
    第1圖說明編碼菌株LMB64的16S rRNA的序列之種系發生位置，出現在此樹上的序列係來自GenBank與LMB64的序列最接近的序列。
    第2A及2B圖呈現穿透式電子顯微鏡(A)及掃描式電子顯微鏡(B)下細菌LMB64的影像。
    第3圖呈現R3培養基的溫度、pH及鹽度之函數所決定的生長最佳化。
    第4圖說明藉由萃取物E0誘導之細胞激素IL-10及IL-12(劑量依賴功效)。
    第5圖說明藉由萃取物E0誘導之表面分子CD80、CD86、CD83及CD54(劑量依賴功效)。
    第6圖說明藉由萃取物E0抑制IgE受體。
    第7圖說明藉由萃取物ES0活化TLR2。
    第8圖說明藉由萃取物ES0活化TLR4。
    第9圖說明藉由萃取物ES0活化TLR5。
    第10圖說明藉由萃取物ES0之特異性PAR2拮抗劑活性。
    第11圖說明藉由萃取物ES0誘導抗菌胜肽及蛋白質。
    第12圖包含萃取物ES0之SDS-PAGE跑膠圖。 較佳實施例的詳細描述
    根據第一實施例，本發明係關於一非致病性革蘭氏陰性細菌，其屬於乙型變形菌綱(Betaproteobacteria)，奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)之亞科，其編碼16S rRNA的基因的核苷酸序列包括或包含序列SEQ ID No. 1，或任何與該序列SEQ ID No. 1有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%相同性的核苷酸序列。
    於一較佳的方式中，本發明係關於一非致病性革蘭氏陰性細菌，其屬於乙型變形菌綱(Betaproteobacteria)，奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)之亞科，特徵在於該細菌的16S rRNA基因的核苷酸序列包括或包含序列SEQ ID No. 1。
    在本發明的內文中，兩核酸序列之間的「百分比相同性」表示兩將要被比較的序列之間相同核苷酸的百分比，其係在最好的配對(最佳配對)之後獲得，其中此百分比係純粹地統計的且該兩序列之間的差異係隨機分佈且遍及其整個長度。兩核酸序列之間的序列比較通常係藉由比較這些序列在以最佳的方式配對其等之後而做到，其中可就每個片段或每個「比較窗」而做到該比較。用於比較的序列之最佳配對，除了手動地，可藉由Smith及Waterman(1981)[Ad. App. Math. 2:482]的局部同源性演算法之方式、藉由Needleman及Wunsch(1970)[J. Mol. Biol. 48:443]的局部同源性演算法之方式、藉由Pearson及Lipman(1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. The USA 85:2444]的相似性搜尋方法之方式或藉由使用此等演算法的電腦軟體(575 Science Dr.,Madison,WI，遺傳集團電腦，威斯康辛遺傳軟體包裹中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，或BLASTN或BLAST P電腦軟體)之方式而實行。
    兩核酸序列之間的百分比相同性係藉由比較此等兩配對序列於最佳方式而決定，其中將要被比較的核酸序列關於此兩序列間用於最佳配對的參照序列可包括添加或缺失。百分比相同性係藉由決定該兩序列之間核苷酸係相同的位置之數目、藉由將此相同位置的數目除以比較窗中位置的總數以及藉由將所獲得的結果乘以100以獲得此等兩序列之間的百分比相同性而計算出。
    例如，「BLAST 2序列」程式(Tatusova et al.,“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences,”FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)，可得於http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html，可以內定參數而使用(特別是對於參數「開頭鴻溝罰分」：5以及「延伸鴻溝罰分」：2；其具有經選擇的母體，例如程式所建議的「BLOSUM 62」母體)，將要被比較的兩序列之間的百分比相同性係直接藉由該程式而計算。亦可能使用其他程式，諸如「ALIGN」或「Megalign」軟體(DNASTAR)。
    根據另一實施例，根據本發明的細菌包括至少一質體，該質體包含序列SEQ ID No. 2，或任何與該序列SEQ ID No. 2有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%相同性的序列。
    於一較佳的方式中，細菌LMB64包括至少一包含序列SEQ ID No. 2的質體。
    根據本發明一較佳實施例，細菌LMB64特徵在於其為非線狀。
    該細菌LMB64之其他特徵將於下實例中被詳細說明。
    此外，本發明細菌LMB64已依據布達佩斯條約以申請人之名於2010年4月8日寄存於巴黎巴斯德研究所之Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)，編號為I-4290。
    因此，本發明之一目標為於2010年4月8日寄存於CNCM之細菌，編號為I-4290，或同源物、後代或任何其他突變體。
    用語「突變體」表示直接由菌株I-4290而來之任何細菌且可包含天然突變或重組，諸如，例如，關於細胞生長的任何重組、細胞分裂(基於發生在細菌分裂或DNA複製期間之錯誤的突變)或任何其他天然選擇之機制，諸如對給定化合物具有抗性或成為有抗性的突變體之選擇。包括在此等突變體之間者係由菌株I-4290而來之任何細菌，其在其基因體序列(或其質體)中包含一或多個突變，其中突變係藉由輻射、藉由病毒、藉由跳躍子或藉由致突變化學品所引起。
    根據本發明第一實施例，由細菌培養物，整個生物量可藉由各種已知的方法而分離，諸如，例如，藉由過濾、與醇類(乙醇、異丙醇、異丁醇)凝集，藉由在具有經刮除的預先層之圓柱體上乾燥等等，以及而後於冷凍乾燥或熱去活化形式使用。
    根據另一較佳實施例，本發明係關於對細菌萃取物之一般方式，亦稱為細菌部分，其係獲自如上所述的細菌之懸浮液，即細菌LMB64。
    用語「細菌萃取物」表示細菌生物量之任何萃取物或部分或該萃取物之任何活性部分。例如，如此之萃取物可獲自細菌LMB64之培養物，其中製備方法包含至少一胞溶細菌之步驟以及一藉由離心或藉由過濾而分離其所構成的各種部分之步驟。
    於一非限制性的方式中，根據本發明的萃取物可包含經濃縮，例如，藉由離心的培養基中分離出的細菌細胞；或經濃縮的細菌細胞，其已進行其中細胞封已藉由熟習此藝者已知的任何手段，諸如藉由超音波或高壓蒸氣滅菌的作用而被破壞的操作；或藉由過濾所獲得的上清液。
    根據本發明的萃取物製備方法之一重要步驟包含除去各種胞內組份，諸如，例如，核酸(染色體DNA、染色體外環狀DNA、質體)、核糖體以及胞內儲存的物質，諸如肝醣、澱粉以及聚-β-羥丁酸酯等等。
    於一較佳的方式中，根據本發明的細菌萃取物係在以除去胞內組份如此之方式處理該細菌懸浮液之後而獲得。
    結果是根據本發明的萃取物主要地包括來自膜、來自周質空間及/或來自胞外空間的組份。
    更特別是，該胞內組份包含至少核酸。
    除了除去胞內化合物之外，且作為非限制性示例，在細菌胞溶且離心之後，對於熟習此藝者可輕易地分離培養上清液的組份(此後為S0部分)以及構成沉澱物的組份(此後為E0)。例如，可建議S0與E0的構成物之間的分開閾值為約100 kDa之分子量。因此，S0部分的構成物具有，對於大部分而言，分子量小於100 kDa，而E0部分的組份則具有，對於大部分而言，分子量大於100 kDa。
    更特別是，因此可以藉由熟習此藝者已知的技術萃取以及將培養上清液(S0)中所找到的生物分子與主要包含表面蛋白及位於細菌的周質空間中之蛋白質(E0)的生物分子分開。
    根據本發明之一實施例，細菌萃取物包括E0部分，其包含至少膜蛋白、周質蛋白及來自鞭毛的蛋白質。
    周質蛋白包括位於革蘭氏陰性細菌的周質空間中之蛋白質，其可藉由滲透震撼或藉由在含有促溶劑(chaotropic agent)或清潔劑的培養基中培養而被釋放(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition: Sambrook and Russell. CSHL Press)。
    來自鞭毛的蛋白質包括鞭毛的多聚體蛋白或鞭毛的片段。以清潔劑繼而以超高速離心分離(在CsCl梯度存在下)供單離及純化整個細菌鞭毛的方法係在文獻中已被描述。在本發明中，萃取方法的示例使得回收鞭毛片段成為可能。
    膜蛋白包括錨定在膜中的蛋白質且其一部分係暴露在表面上(外膜蛋白，或稱為Omp)、黏附在膜表面的蛋白質、脂蛋白以及孔蛋白(Ward JB.,Microbial adhesion to surfaces,1980)。
    於一較佳方式中，該膜蛋白包含孔蛋白、Omp A、脂多醣及/或脂蛋白。
    根據本發明另一實施例，較佳為使用S0部分。
    更特別是，根據本發明的細菌萃取物包括S0部分，其包含至少經分泌的胜肽與蛋白質以及二次代謝物。
    經分泌的胜肽與蛋白質包括由細菌LMB64所天然產生及分泌的胜肽與蛋白質，其可藉由離心或藉由過濾而回收。
    二次代謝物包括細菌LMB64所產生及分泌在培養基中的小分子。
    脂多醣在S0部分中的存在在此應被提及，確實，脂多醣，雖然其主要在E0部分中被發現，儘管如此仍在S0部分中被發現少量。
    於一有利的方式中，E0部分及S0部分可以將獲得ES0部分如此之方式組合，其係藉由，例如，使培養基溫育及於鹼性培養基(pH 9至11)中於4℃之溫度反應約5小時、藉由離心及藉由在0.2 μm過濾以獲得清澈的ES0溶液。
    細菌萃取物ES0係因此由，尤其是，膜蛋白、脂多醣、周質蛋白、鞭毛的蛋白質片段以及細菌所產生的初級及二次代謝物所構成。
    於一較佳的方式中，萃取物ES0具有一蛋白質廓形，其包含至少，根據SDS-PAGE技術，12個條帶，其包括三個主要的條帶分別對應於分子量(相關於分子標準品所給予的約略分子量，特別是由Bio-Rad Laboratories所提供者)範圍介於下列之間：
    條帶1：30 kDa與36 kDa，較佳為34 kDa；
    條帶2：41 kDa與45 kDa，較佳為43 kDa；
    條帶3：47 kDa與51 kDa，較佳為49 kDa。
    根據本發明另一實施例，細菌萃取物包括ES0部分，其包含至少E0部分與S0部分。
    根據本發明之一較佳實施例，細菌萃取物包括具有藉由SDS-PAGE所獲得的蛋白質廓形之ES0部分，其包括三個主要的條帶分別對應於分子量範圍介於30 kDa與36 kDa、41 kDa與45 kDa以及47 kDa與51 kDa之間。
    根據本發明之一較佳實施例，細菌萃取物包括具有藉由SDS-PAGE所獲得的蛋白質廓形之ES0部分，其包括三個主要的條帶分別對應於分子量34 kDa、43 kDa以及49 kDa。
    根據另一方面，本發明描述一用於製備細菌萃取物的方法，包含下列步驟：
    a)　於適當的培養基中培養細菌LMB64；以及
    b)　除去胞內組份。
    根據另一實施例，根據本發明的方法包含一用於製備細菌萃取物S0的方法，其中該方法包含下列步驟：
    a)　於適當的培養基中培養細菌LMB64；
    b)　離心該培養物；以及
    c)　回收上清液S0。
    根據另一實施例，根據本發明的方法包含一用於製備細菌萃取物E0的方法，其中該方法包含下列步驟：
    a)　於適當的培養基中培養細菌LMB64；
    b)　離心該培養物以及除去上清液；
    c)　將由步驟b)所獲得的生物量以除去胞內組份如此的方式處理；以及
    d)　回收基底E0。
    於一較佳的方式中，步驟c)包含以超音波處理由步驟b)所獲得的生物量，而後一初始離心目標在除去包含該胞內組份的沉澱物，而後上清液之第二次離心。
    根據另一實施例，根據本發明的方法包含一用於製備細菌萃取物E0的方法，其中該方法包含下列步驟：
    a)　於適當的培養基中培養細菌LMB64；
    b)　離心該培養物以及除去上清液；
    c)　以超音波處理由步驟b)所獲得的生物量；
    d)　離心該經超音波處理的生物量以及除去所獲得的生物量；
    e)　離心由步驟d)所獲得的上清液；以及
    f)　回收基底E0。
    應注意的是以上所描述的各種方法係提供以僅用於說明且熟習此藝者已知的任何方法可被使用。
    如由下面示例可清楚瞭解，除了對於此類型的萃取物所預期的活性，申請人已展示數種之前從未被描述過的新穎活性。
    本發明之第一有利的方面，關於免疫調節，在於促發炎細胞激素的調節性質，更特別是，根據本發明的細菌及/或萃取物的使用顯著地誘導細胞激素IL-10、IL-12及TNF-α，其等偏向涉及於Th1免疫反應中，並且顯著地抑制細胞激素IL-4及IL-6。結果為蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)的活化及轉回到Th1/Th2平衡。
    此外，另一觀察顯示使用根據本發明的細菌及/或萃取物使得大大地減少IgE受體的表現成為可能，其為有興趣地因為IgE可能會造成過敏現象。
    本發明另一優點在於，如可由示例清楚瞭解，使用根據本發明的細菌及/或萃取物會誘導抗菌胜肽諸如，例如，胜肽hBD-2、hBD-3、S1007A及LL-31的產生之事實。
    更特別是，如上所述，細菌線狀透明顫菌(Vitreoscilla filiformis)的萃取物(Guniche A. et al.,Eur J Dermatol 2006;16:380)已知對TLR2具有活性，基於OmpA的存在，以及對TLR4具有活性，基於脂多醣的存在。由於線狀顫菌(V. filiformis)細菌中沒有鞭毛，由線狀顫菌(V. filiformis)所獲得的萃取物沒有TLR5活性。
    做為第一次，申請人描述根據本發明的細菌萃取物，其除了對TLR2及TLR4具有活性外，對TLR5具有活性。
    本發明因此係關於諸如如上所描述的細菌及/或細菌萃取物做為TLR2、TLR4及TLR5活化劑的用途。
    於一較佳的方式中，該TLR2、TLR4及TLR5的細菌萃取物活化劑包含一萃取物，該萃取物包含所有或部份由鞭毛而來的蛋白質。在此案例中，做為示例，該萃取物較佳為萃取物E0或萃取物ES0。
    該TLR5活化活性係具有重大的興趣，因為TLR5已知會誘導特定抗菌胜肽諸如牛皮癬素(S100A7)及hBD-2(Glaser et al.,Journal of Investigative Dermatology(2009) 129,641-649)。此外，TLR5促效劑與TLR2及TLR4的促效劑在手術中作用，因而使得能夠造成抗菌胜肽的產生成為可能。已顯示藉由以抗體阻斷TLR5，後者被產生少許或根本沒有。
    此方面係因此特別地有創造性就對於本發明的細菌及/或萃取物供免疫調節的應用而言。
    此外，於一不可預期的方式，相對於當今已描述的細菌萃取物，申請人亦展示對於PAR2的拮抗活性。此活性在抗發炎治療的內容中係具有重大的興趣。
    本發明因此係相當特別地關於細菌及/或細菌萃取物之用途，諸如以上所描述之作為PAR2拮抗劑。
    於一較佳的方式中，該PAR2拮抗劑細菌萃取物包含萃取物S0或萃取物ES0。
    PAR2在內皮細胞、結腸肌細胞、腸細胞、腸神經元、免疫細胞及角質細胞中係過度表現。大量存在於環境中的蛋白酶(胰蛋白酶、中性蛋白酶)在N端切割PAR2、暴露一特定胜肽，其活化此相同的受體(自我活化的現象)，結果，此活化促發炎細胞激素的產生並引發發炎現象(Vergnolle,N.,2009 Pharmacol. Ther. 123:292-309)，此現象係在野生型老鼠中觀察到但在KO老鼠(PAR2缺陷)中則未出現。以抗蛋白酶及/或PAR2拮抗劑治療使得避免此發炎現象成為可能。
    所有這些活性的組合與協同作用賦予此細菌LMB64，或任何由該細菌而來之萃取物，一高度的潛力以治療發炎疾病及，尤其特別是，其中係涉及PAR2及/或其中免疫系統係弱化、擾亂或不平衡的發炎疾病。
    本發明因此係關於一諸如上文所描述的細菌及/或來自該細菌的細菌萃取物於製備一組成物之用途，該組成物係意欲用於皮膚科發炎病症之治療及/或預防。
    於一較佳的方式中，該皮膚科發炎病症包含異位性皮膚炎、搔癢、濕疹及牛皮癬。
    根據另一實施例，本專利申請案之發明係關於一組成物，其包含至少一根據本發明之細菌及/或細菌萃取物作為活性成分。
    本發明因此係關於，於一較佳的方式中，一化妝品或皮膚科組成物。
    根據本發明之組成物係關於皮膚科發炎病症之治療。
    於一較佳的方式中，該皮膚科發炎病症包含異位性皮膚炎、搔癢、濕疹及牛皮癬。
    根據本發明之組成物可特別含有添加物及配方輔助劑諸如乳化劑、增稠劑、成膠劑、水結合劑、展開劑、安定劑、成色劑、芳香劑及防腐劑。
    根據本發明之化妝品或皮膚科組成物進一步包含一或多典型的皮膚科上相容之賦形劑。
    根據本發明之組成物可被製備為於油包水(W/O)或水包油(O/W)乳化液、多重乳化液諸如，例如水包油包水(W/O/W)或油包水包油(O/W/O)乳化液、微乳化液之形式或於水分散液或脂分散液、凝膠或氣溶膠之形式。
    皮膚科上或化妝品上相容的賦形劑可為熟習此藝者所知者之中之任何賦形劑，以獲得於乳劑、乳霜、香膏、油脂、洗劑、凝膠、發泡膠、髮膠、噴霧等等之形式之用於局部施用的組成物。
    除了皮膚科及化妝品組成物之外，本發明亦關於供用作為藥物之藥學組成物。
    本發明因此係關於一藥學組成物，其進一步包含一藥學上可接受的載劑。
    在本案說明書中，「藥學上可接受的載劑」意指作為藥學組成物之一部分的化合物或化合物之組合，其不會造成二次反應且其，例如，幫助活性化合物之投藥、增加其在體內之壽命及/或功效、增加其於溶液中之溶解度或改善其保存。該藥學上可接受的載劑係廣為週知且可根據所選用活性化合物的本質及投藥模式而被熟習此藝者所調整使用。
    較佳地，該化合物可藉由肌肉內、皮內、腹膜內或皮下途徑，或藉由經口路徑而全身性地投藥。包含根據本發明之抗體的組成物可以數個劑量、分散於時間上被投藥。
    投藥、給藥排程及製劑形式之最佳模式可根據在建立適用於病患之治療時普遍上考慮到的準則而決定，諸如，例如，病患的年紀或體重、病患一般健康的嚴重性、對該治療之耐受性以及注意到的副作用。
    本發明在考量到以下舉例說明本發明而不限制其範圍之實施例時可被更加瞭解。 實施例1：細菌LMB64之篩選及定性
    細菌AV13係分離自地下水。
    新穎細菌LMB64的分類學位置係提議於第1圖中。
    更特別地，細菌LMB64係桿狀，具有大約2.3 μm(±0.3)之長度及1.0 μm(±0.1)之寬度。此細菌之一可區別的特徵係極性鞭毛之存在(第2A及2B圖)。如亦可在此等影像中所見，細菌LMB64係非線狀細菌。
    如上所提及，細菌LMB64具有一大約11 kbp之環狀質體，此質體被完整地定序(SEQ ID No. 2)。
    編碼16S rRNA的基因亦被定序(SEQ ID No. 1)。細菌在發酵槽中於合成培養基中培養。當培養基中具有低濃度之碳基材時生長速率較高。
    受測之培養基為R3、MS-葡萄糖及LB培養基，其組成份係分別描述在下表1a、1b及1c中。

    作為培養基的函數之細菌LMB64的生長速率係如下表2所呈現。
    生長最佳化係作為R3培養基溫度、pH及鹽度的函數而決定(第3圖)。
    可被該細菌同化的碳源係藉由使用API 50CH設備而被定性(培養溫度：25℃)，結果摘要如下表3中。

    顯示在API ZYM設備上的酵素活性係：鹼性磷酸酶、脂酶(C4)、脂酶/脂解酶(C8)、白胺酸芳基醯胺酶、纈胺酸芳基醯胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶及α-葡萄糖苷酶。
    細菌LMB64係對所有如下表4中所見之受測抗生素敏感。
    實施例2：用於萃取E0、S0及ES0部分之方法
    預培養：菌株AV13係接種於含有250 ml之MS葡萄糖丙酮酸培養基的錐形瓶中(見如下表5)，接著在30℃(pH 7)及200 rpm下震盪培養約40小時，直到獲得OD600 1.5。

    培養：預培養物接著接種於含有3.7 l之MS丙酮酸培養基+114 ml之20%葡萄糖溶液的發酵槽中(Applikon)。溫度感應器調節溫度較佳地接近30℃。氧氣感應器(AppliSens)係使用以維持培養基中溶氧的濃度為18-25%。pH感應器(AppliSens)係使用以透過固定流速幫浦藉由添加10% NH4OH而維持pH於7。使用維吉伍德(Wedgewood)分析感應器以即時監控吸光度的改變。培養物係程式化為批次饋給模式；透過可變的流速幫浦，培養物係被提供20%葡萄糖溶液。當OD600 22-26時發酵停止，一般在大約30小時後。
    萃取S0：上清液係藉由在4℃及4000 g離心1小時而自生物量分離。
    萃取E0：：取出濕生物量於NaCl溶液(1 M)中，在4℃及9000 g離心15分鐘後，捨棄上清液且取出沉澱物於1 M NaCl溶液中。樣品管接著浸放在電力設定50-60 W的冷超音波浴中歷時數分鐘。在4℃及6000 g離心30分鐘後，捨棄沉澱物並回收上清液。加入兩倍體積的冰乙醇且懸浮液係留在4℃過夜。在4℃及6000 g離心30分鐘後，捨棄上清液且取出沉澱物於25 mM Tris緩衝液，pH 8.8中。
    萃取ES0：培養物係以鹼性緩衝液調至鹼性pH(pH 9-11)。下一步為恆溫在4℃之溫度下攪拌5小時。在離心後，預過濾上清液以去除殘存的生物量殘渣，且接著在0.2 μm過濾器上過濾，獲得澄清黃色溶液(ES0)。
    蛋白質係根據DC蛋白質試驗套組II(Bio-Rad)的操作流程而試驗，糖類係根據酚/硫酸方法(Dubois,M. et al.,1956)而試驗葡萄糖當量。
    作為一示例，下列表6呈現上述條件下所獲得的萃取物ES0之某些特定特徵。
    可清楚地瞭解到以上資料係呈現在本文中僅供說明性的目的。
    更精確地來說，關於由SDS-PAGE所獲得的蛋白質廓形之資料具有3條主要的條帶。
    SDS-PAGE操作流程：
    萃取物ES0係取出於緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA；2.5% SDS及0.01%溴酚藍)及1 M DTT(1,4-二硫蘇糖醇)中。樣本及分子量標記的混合物(WesternC,Bio-Rad)係分別沉積於8-16% SDS-PAGE丙烯醯胺膠體(GeBaGel,Gene Bio-Application)的槽孔中。移動緩衝液含有2.5 mM Tris，19.2 mM甘胺酸及0.01% SDS(w/v)。移動係允許在固定電壓160V下進行大約1小時(GeBaGel system)，接著以卡馬西藍(Coomassie Blue)(Instant Blue,Expedeon)染色蛋白質條帶。以相關於已知標準品(STD)計算大小。
    所獲得的膠體係呈現在第12圖中。
    根據本發明之一實施例，此三個條帶分別具有大約34 kDa、43 kDa及49 kDa之分子量。 實施例3：E0及ES0部分的藥理學活性之展示
    蘭格漢氏細胞(LC)係自分離自白血球衣(Buffy-Coat)囊的人類單核白血球於體外產生，自白血球衣囊係來自法國國家血液服務(Etablissement Fran ais du Sang(EFS) Pyr n es M diterran e)：於Ficoll梯度(淋巴球分離培養基，密度1.077 g/ml)上分離且藉由磁性免疫篩選(Miltenyi Biotec)純化；LC分化係在細胞激素雞尾酒(GM-CSF/IL-4/TGFβ)存在下進行6天。分布在24孔盤的RPMI-5% FCS培養基中之LC係以萃取物ES0培養24小時。
    表面分子係藉由流式細胞儀(FACSCalibur,BD Biosciences)以三或四重染色分析：CD1a/CD54/CD80/CD83/CD86/FcεRI；分泌在培養基上清液中的細胞激素係以流式細胞儀中的細胞儀顆粒陣列(Cytometry Bead Array)(cat. no. 550749,BD)分析：IL-6、IL-8、TNF、IL-4、IL-10、IL-12。
    3.1　供Th1極化的關鍵細胞激素之誘導
    萃取物E0依據劑量依賴式的效果誘導由蘭格漢氏細胞的細胞激素IL-10及IL-12之表現(第4圖)。此等細胞激素促進未活化T淋巴細胞的TH1極性之誘導。
    3.2　蘭格漢氏細胞成熟及IgE受體(FcεRI)抑制作用
    萃取物E0誘導蘭格漢氏細胞的成熟，觀察到劑量依賴式的誘導表面分子CD80、CD86、CD83及CD54(第5圖)。類似地，萃取物E0依據劑量依賴式的效果抑制IgE受體(FcεRI)的表現(第6圖)。
    3.3　類鐸受體(TLRs)之活化
    ES0之TLR活性係使用共轉染有TLR2、TLR4或TLR5基因以及報導基因NFκB-sAP(分泌性鹼性磷酸酶)的HEK293細胞模式而對TLR2、TLR4及TLR5評估。配體對其TLR的結合導致轉錄因子NFκB的活化；sAP係置於可被NFκB誘導的啟動子之控制下。此報導基因使得能夠透過TLRs監控細胞訊息：由ES0所誘導以及由比色試驗所測得的sAP之釋放使得能夠決定此活性成分的活性為TLR2、TLR4或TLR5同效劑。
    此研究係在下列人類胚胎腎臟(HEK293)細胞株上進行：
    HEK-BlueTM-2細胞供TLR2，
    HEK-BlueTM-4細胞供TLR4，
    HEK-BlueTM-5細胞供TLR5，
    此等細胞株係維持在HEK-BlueTM篩選10% FCS培養基中且之後分布於96孔盤HEK-BlueTM偵測培養基中，在ES0存在下歷時18小時。該等盤係使用比色計在620 nm下讀取。
    3.3.1 TLR2之活化
    萃取物ES0依據劑量依賴式的效果誘導TLR2之活化，最大活性在100 ng/ml(第7圖)。
    3.3.2 TLR4之活化
    萃取物ES0誘導TLR4之活化，最大活性在10 ng/ml(第8圖)。
    3.3.3 TLR5之活化
    萃取物ES0於劑量依賴式的方式誘導TLR5之活化，此活性在抗-TLR5抗體存在下係被抑制，顯示萃取物ES0對TLR5的活化特異性(第9圖)。
    3.4　蛋白酶活化受體2(PAR2)之抑制作用
    萃取物ES0對蛋白酶活化受體之抑制作用係在來自細胞株(HaCaT)的人類角質細胞上，藉由測量以角質層胰臟解酵(stratum corneum tryptic enzyme)(SCTE)特異性刺激PAR2後所誘導的胞內鈣內流來評估。使用螢光探針Fluo-4/AM：其酯化形式促進其藉由被動擴散穿透入細胞中；惟有去酯化形式連接到鈣離子才可在485 nm螢光下激發並於535 nm發射。
    螢光探針係在接種於96孔盤中的細胞中併納30分鐘，且接著溫育萃取物ES0歷時30分鐘。根據注射SCTE之前及之後的動力學即時地逐孔測量鈣流。該等盤係使用Mithras LB940TM讀取機(Berthold )讀取。
    萃取物ES0以劑量依賴的方式抑制由人類SCTE所誘導的PAR2活化(第10圖)。
    3.5　角質細胞上異位性皮膚炎目標之調節作用
    此研究係在正常人類表皮角質細胞(NHEK,K-SFM培養基)上以誘導異位性皮膚炎表現型的內容中進行。ES0的活性係在以Poly I:C+IL-4+IL-13+TNF-α刺激24小時後具有異位性皮膚炎表現型的角質細胞上研究，並且藉由PCR陣列在32個選擇的基因群之表現上分析。
    在角質細胞上，萃取物ES0依據劑量依賴的效果抑制涉及異位性皮膚炎病理學的媒介物中的15個目標基因，如可清楚地於下表7中所見(結果顯示所獲得的各目標基因之抑制百分比)。
    3.6　抗菌胜肽之誘導
    萃取物ES0對抗菌胜肽及蛋白之表現的活性係在HaCaT角質細胞細胞株上研究：在ES0存在下處理3小時後，回收細胞以供由定量RT-PCR分析抗菌目標的表現；萃取總RNA並試驗；在反轉錄mRNA為cDNA後，於iCycler定量PCR系統(Bio-Rad)上在96孔盤中進行定量PCR擴增步驟。所獲得的結果係以由ES0處理後mRNA相對於不具活性成分的控制組之相對數量(RQ)表現。IL-1β係相同使用作為抗菌胜肽表現的參考正誘導劑。感興趣基因的表現被認為受到調節，當RQ2(誘導)或RQ0.5(抑制)時。
    萃取物ES0誘導抗菌胜肽及蛋白hBD2、hBD3、S1007A、LL37、PI3、RNase 7及NOD2之表現(第11圖)。 實施例4：包含細菌萃取物ES0的「身體及面部」乳霜之配方
    萃取物ES0：0.1-5%
    月見草油：1-3%
    甘胺酸：0.1-0.4%
    神經醯胺：0.1-0.3%
    保濕劑：5-20%
    乳化劑：2-7%
    羊脂酸/辛酸三酸甘油酯：1-10%
    防腐劑
    水qsp 100% 實施例5：包含細菌萃取物ES0的「身體及面部」清潔凝膠之配方
    萃取物ES0：0.1-5%
    月見草油：0.5-2%
    甘胺酸：0.1-0.4%
    神經醯胺：0.1-0.4%
    界面活性劑：10-20%於活性態樣
    保濕劑：5-15%
    防腐劑
    水qsp 100%
    第1圖說明編碼菌株LMB64的16S rRNA的序列之種系發生位置，出現在此樹上的序列係來自GenBank與LMB64的序列最接近的序列。
    第2A及2B圖呈現穿透式電子顯微鏡(A)及掃描式電子顯微鏡(B)下細菌LMB64的影像。
    第3圖呈現R3培養基的溫度、pH及鹽度之函數所決定的生長最佳化。
    第4圖說明藉由萃取物E0誘導之細胞激素IL-10及IL-12(劑量依賴功效)。
    第5圖說明藉由萃取物E0誘導之表面分子CD80、CD86、CD83及CD54(劑量依賴功效)。
    第6圖說明藉由萃取物E0抑制IgE受體。
    第7圖說明藉由萃取物ES0活化TLR2。
    第8圖說明藉由萃取物ES0活化TLR4。
    第9圖說明藉由萃取物ES0活化TLR5。
    第10圖說明藉由萃取物ES0之特異性PAR2拮抗劑活性。
    第11圖說明藉由萃取物ES0誘導抗菌胜肽及蛋白質。
    第12圖包含萃取物ES0之SDS-PAGE跑膠圖。
    <110>　皮爾法伯皮膚化妝品公司　皮爾和瑪麗居里大學　國際科學研究中心
    <120>　新穎細菌及該細菌之萃取物以及其於皮膚科之用途
    <130>　D29306
    <150>　FR 1061081
    <151>　2010-12-22
    <160>　2
    <170>　PatentIn版本3.5
    <210>　1
    <211>　1487
    <212>　DNA
    <213>　人工
    <220>
    <223>　新穎細菌LMB64，屬於乙型變形菌綱之類別，來自地下水
    <400>　1


    <210>　2
    <211>　10948
    <212>　DNA
    <213>　人工
    <220>
    <223>　新穎細菌LMB64，屬於乙型變形菌綱之類別，來自地下水
    <400>　2






    权利要求:
    Claims (20)
    [1] 一種非致病性革蘭氏陰性細菌，其屬於乙型變形菌綱(Betaproteobacteria)，奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)之亞科，特徵在於該細菌的16S rRNA基因之核苷酸序列包括序列SEQ ID No. 1。
    [2] 如申請專利範圍第1項之細菌，特徵在於其包括至少一質體，該質體包含序列SEQ ID No. 2或與該序列SEQ ID No. 2有至少80%相同性之任何序列。
    [3] 如申請專利範圍第1或2項之細菌，特徵在於其為非線狀。
    [4] 如申請專利範圍第1至3項任一項之細菌，於2010年4月8日寄存於CNCM，編號為I-4290，或任何其他突變體。
    [5] 一種細菌萃取物，其係獲自如申請專利範圍第1至4項任一項之細菌的懸浮液。
    [6] 如申請專利範圍第5項之細菌萃取物，特徵在於其係在以除去胞內組份如此之方式處理該細菌懸浮液後而獲得。
    [7] 如申請專利範圍第6項之細菌萃取物，特徵在於該胞內組份包括至少該等核酸。
    [8] 如申請專利範圍第6或7項之細菌萃取物，特徵在於其包括E0部分，該E0部分包含至少膜蛋白、周質蛋白及來自鞭毛的蛋白質。
    [9] 如申請專利範圍第8項之細菌萃取物，特徵在於該膜蛋白包含孔蛋白、Omp A、脂多醣及/或脂蛋白。
    [10] 如申請專利範圍第6或7項之細菌萃取物，特徵在於其包括S0部分，該S0部分包含至少經分泌的胜肽與蛋白質以及二次代謝物。
    [11] 如申請專利範圍第6或7項之細菌萃取物，特徵在於其包括ES0部分，該ES0部分包含至少E0部分及S0部分。
    [12] 如申請專利範圍第11項之細菌萃取物，特徵在於其包括具一由SDS-PAGE所獲得的蛋白質廓形之ES0部分，其包括三個主要的條帶分別對應於分子量範圍介於30 kDa與36 kDa、41 kDa與45 kDa以及47 kDa與51 kDa之間。
    [13] 一種如申請專利範圍第1至4項任一項之細菌及/或如申請專利範圍第5至9及12項任一項之細菌萃取物於製備一組成物之用途，該組成物係欲用於活化TLR2、TLR4及TLR5。
    [14] 一種如申請專利範圍第1至4項任一項之細菌及/或如申請專利範圍第10或12項之細菌萃取物於製備一PAR2拮抗劑組成物之用途。
    [15] 一種如申請專利範圍第1至4項任一項之細菌及/或如申請專利範圍第5至12項任一項之細菌萃取物於製備一組成物之用途，該組成物係欲用於皮膚科發炎病症之治療及/或預防。
    [16] 如申請專利範圍第13項之用途，特徵在於該皮膚科發炎病症包含異位性皮膚炎、搔癢、濕疹及牛皮癬。
    [17] 一種組成物，其包含至少一如申請專利範圍第1至4項任一項之細菌及/或如申請專利範圍第5至12項任一項之細菌萃取物作為活性成分。
    [18] 如申請專利範圍第15項之組成物，用於皮膚科發炎病症之治療。
    [19] 如申請專利範圍第18項之組成物，特徵在於該皮膚科發炎病症包含異位性皮膚炎、搔癢、濕疹及牛皮癬。
    [20] 如申請專利範圍第17至19項任一項之化妝品或皮膚科組成物，特徵在於其進一步包括一或多典型的皮膚科上相容之賦形劑。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    FR1061081A|FR2969657B1|2010-12-22|2010-12-22|Nouvelle bacterie et extraits de ladite bacterie et leur utilisation en dermatologie|
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